Cultivo de microalgas y fotobiorreactores

Zárate-Rivera, Ana Karen (2024). Copyright Algae Bank CCAB 2024. El autor dispone de todos los derechos sobre el texto y las imágenes y no permite que se reproduzcan bajo ningún concepto. 

Este artículo se divide en dos: un manual de cuidados primarios para cultivos de microalgas y una revisión de consideraciones técnicas de los cultivos en fotobiorreactores. 

Cuidados primarios

Una vez haya recibido sus cultivos de microalgas inmediatamente coloque en un lugar con iluminación. Para cultivos líquidos, afloje la tapa sin retirarla completamente, esto permite la respiración celular. La mayoría de los cultivos algales no sobrevivirán en condiciones de ausencia de oxígeno, si esta actividad no es habitual en su laboratorio, deje una nota a los técnicos. 

La intensidad de la iluminación está directamente relacionada la velocidad de crecimiento, por ello para manutención a largo plazo configure luz tenue (~15 watts, 100 lux – 400 lux), esto evitará la fotooxidación. Para crecimiento elija una iluminación blanca media (30 watts, 400 lux en adelante). Revise con detenimiento las condiciones de iluminación para cada microalga, algas como Haematococcus pluvialis o Anabaena inaequalis no sobreviven a condiciones altas de luz. 

Observación de muestras al microscopio

Para cultivos líquidos
Trabaje en condiciones de esterilidad. Agite el frasco contenedor para obtener una solución homogénea o tome células de los sedimentos. Adicionalmente, puede concentrar sus cultivos en centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos.
Con micropipeta, tome 100 μL de cultivo. Coloque la muestra de cultivo sobre un portaobjetos limpio. Con cuidado, coloque un cubreobjertos de manera gentil sobre la muestra. Coloque la preparación en la platina del microscopio y ajuste el revólver del objetivo 4X.

Ajuste el enfoque macrométrico hasta obtener una imagen, ajuste el enfoque micrométrico para obtener una imagen más nítida. Para observar los detalles de las células repita el proceso con los siguientes objetivos, las células de tamaño superior a 100 μm pueden verse nítidamente desde los objetivos 4X – 10X.

Para cultivos sólidos
Trabaje en condiciones de esterilidad. Utilice un asa de nicromo. Pase la punta del asa de nicromo sobre una flama hasta que observe un cambio de color, permita que se tempere y raspe una colonia de microalgas. Frote la muestra sobre un portaobjetos limpio adicionando una gota de agua estéril, a esta preparación se le llama «frotis». Utilizar agua no estéril puede introducir microorganismos del agua y sólidos inorgánicos en su campo de visión. Con cuidado, coloque un cubreobjetos de manera gentil sobre la muestra. Coloque la preparación en la platina del microscopio y ajuste el revólver del objetivo 4X. 

Ajuste el enfoque macrométrico hasta obtener una imagen, ajuste el enfoque micrométrico para obtener una imagen más nítida. Para observar los detalles de las células repita el proceso con los siguientes objetivos, las células de tamaño superior a 100μm pueden verse nítidamente desde los objetivos 4X – 10X.

Indicaciones para la preparación de medios de cultivo

Los medios de cultivo de la CCAB son entregados como macronutrientes en polvo blanco parcialmente hidrosoluble y micronutrientes metales traza en solución estéril.  La naturaleza predominantemente inorgánica de los medios les facilita como medio de mantenimiento de cultivos axénicos (Nichols y Bold, 1965).

1. Determine el volumen de trabajo de su medio de cultivo. La concentración por medio está indicada en gramos por litro (g/L) en el sitio web y en la ficha técnica específica de cada medio. Convierta la cantidad por volumen de trabajo de la siguiente manera: Volumen de trabajo [mL]* g/1000 mL = Y [g]
2. Pese la cantidad de micronutrientes adecuada y suspenda en agua destilada
3. Adicione 1 mL/L de solución de micronutrientes.
4. Ajuste pH de acuerdo a los requerimientos de cada cultivo.
5. El medio puede precipitar, esto no es relevante para su utilidad. De ser necesaria la remoción de sedimentos, después de esterilizar permita su completa sedimentación y decante o filtre.
6. Coloque la preparación en una botella con tapa semi-abierta. 
7. Esterilice en autoclave a 15 PSI, 121 °C, 20 minutos. 
8. Nota: de no contar con autoclave, puede pasteurizar a 100°C durante 1 hora.

Una vez estéril, el medio va a estar extremadamente caliente. Evite quemaduras. Mantenga en el sitio hasta que el material se enfríe. O bien, manipule el material con guantes de color y coloque en un lugar templado y despejado hasta que alcance una temperatura adecuada al tacto.

Indicaciones para la siembra de microalgas

Sólido a sólido
Trabaje en condiciones de esterilidad. Utilice un asa de nicromo. Pase la punta del asa de nicromo sobre una flama hasta que observe un cambio de color, permita que se tempere y raspe una colonia de microalgas abundante. Resiembre en agar fresco por estría cruzada, lo que le permitirá obtener colonias aisladas. Incube a las condiciones de luz y temperatura adecuadas. 

Sólido a líquido
Trabaje en condiciones de esterilidad. Utilice un asa de nicromo. Pase la punta del asa de nicromo sobre una flama hasta que observe un cambio de color, permita que se tempere y raspe una colonia de microalgas abundante. Deposite la totalidad del raspado en medio de cultivo fresco preparado, inicie con un volumen pequeño (50 mL).  Incube a las condiciones indicadas de acuerdo a la especie durante periodos de 4 días a 15 días. 

Líquido a líquido
Trabaje en condiciones de esterilidad, utilice matraces (frascos) estériles o pasteurizados. Siembre un volumen de trabajo del 20%-40% de microalgas y 60%-80% de medio fresco. Incube a las condiciones indicadas de acuerdo a la especie durante periodos de 4 días a 15 días. Adicione un volumen porcentual adicional de medio fresco una vez terminado el periodo de incubación determinado. 

 

Fotobiorreactores de Chlamydomonas reinhardtii (propia, 2019).

Fotobiorreactores

Un biorreactor se define de la manera más simple como: un recipiente para el cultivo de microorganismos que tiene como propósito de obtener un producto. Debe de pensarse como el equivalente de un reactor químico, se combinan los reactivos [X (células o sus partes), S (sustrato)] en condiciones ambientales específicas [temperatura, presión, concentración de oxígeno, agitación] para obtener un producto en un tiempo determinado. 

Los productos que busca sintetizar la biotecnología de microalgas varían de acuerdo a la industria, por ejemplo: enzimas específicas, como lactasas o alcohol deshidrogenasas, productoras respectivamente las microalgas Nannochloropsis (Li, 2023) y Euglena (Inwongwan, 2019); extractos de células completas en la formulación de suplementos alimenticios y bioestimulantes agrícolas; pigmentos, las microalgas como conjunto taxonómico artificial son productoras de una cantidad superior a los 30 pigmentos bioactivos (Lesley, 2019); proteínas recombinantes, como anticuerpos y proteínas testigo RUBY y eGFP (Cha, 2011).

Variables de los fotobiorreactores

Variables cinéticas:

• Concentración de biomasa, X [g/L]
  Biomasa es un término utilizado para hacer referencia a la pasta húmeda de células vivas y muertas que se produce en el tiempo de cultivo. En modelos matemáticos simplificados, esta variable sigue un comportamiento logarítmico típico de una cinética microbiana: siembra, adaptación, crecimiento exponencial, latencia y muerte. X aumenta y disminuye su valor de acuerdo con la etapa de vida del cultivo.
• Concentración de sustrato, S [g/L]
  Referencia a la concentración específica de la fuente de carbono de los cultivos. Para microalgas mixotróficas (que asimilan carbono del medio a la vez que realizan la fotosíntesis), las fuentes de carbono son acetato, glucosa, etanol, y carbonos complejos como granos enteros de cebada. Esta variable decrece en el tiempo. Pueden analizarse más de un sustrato.
• Concentración de producto, P [g/L]
  Referencia a la concentración específica del producto para el que se realiza el bioproceso. Esta variable incrementa en el tiempo.
• Concentración de inhibidores, I [g/L]
  En todos los bioprocesos se lidia con inhibidores del crecimiento. Existe una concentración máxima de S que puede asimilar una célula específica, ya que una  concentración superior a Smáx resulta en la inhibición del crecimiento por saturación de los mecanismos del metabolismo (saturación enzimática). Además de esto, existen moléculas que actúan como «señuelo» enzimático e impiden que el sustrato se pueda unirse al sitio diana, evitando que las células puedan obtener carbono. En microalgas, una irradiancia de luz superior a la máxima genera muerte celular por fotooxidación, esta variable se mide y es básica para el escalamiento de cultivos algales.

  En estudios ambientales toxicológicos, se estudia el papel de inhibición en el crecimiento de microalgas de compuestos como el cobre, mercurio, pigmentos textiles y herbicidas. Las microalgas son la base fundamental de la cadena trófica, por ello, el que un compuesto evite que crezcan significa que generará un daño importante en el ecosistema. Los estudios cinéticos otorgan resultados medibles.
  Un gran modelo de estudio toxicológico es Selenastrum (Barrios-Ziolo, 2016).

Variables mecánicas:

• Geometría
  Los recipientes de cultivo pueden ser cilíndricos, esféricos, en forma de matraz, pueden tener bafles. La geometría de un biorreactor es la base fundamental del régimen de flujo, laminar o turbulento. La geometría específica de biorreactor para cada cultivo de microalgas varía dramáticamente por tratarse de un grupo taxonómico artificial. Chlamydomonas (alga verde) no crecerá en régimen turbulento, ya que las células estallarán por esfuerzo cortante, son células que crecen bien en agitación suave. Porphyridium que secreta exopolisacáridos sulfatados es una productora de biofilm importante, crece mejor en régimen turbulento y de hecho será dificil de producir en un biorreactor que no esté optimizado para la colecta de biomasa de las paredes del mismo.
• Agitación
  Movimiento forzado de las células para la asimilación de nutrientes y desecho de metabolitos, mediante agitación externa en máquinas de agitación orbital, o interna, mediante propelas marinas instaladas dentro del sistema. Se mide en revoluciones por minuto RPM.
• Aireación
  Flujo volumétrico ded aire, para la transferencia de oxígeno a las células, las reacciones metabólicas se producen dentro de la burbuja de aire. Definido en volume vessel/minute VVM (L/min). Impacto directo en la concentración de O2 disuelto y CO2 disuelto. 

Tipos de fotobiorreactores

Sistemas cerrados: Existe una barrera física entre los cultivos de microalgas y el ambiente. Esto permite el trabajo con cultivos puros, o  cultivos de muy alta calidad, en el escalamiento a escalas muy grandes. La aireación se aplica utilizando filtros de grado microbiológico, de tamaño de poro muy pequeño 0.45 μm – 0.20 μm, hidrofóbicos o hidrofílicos. Las predicciones matemáticas funcionarán efectivamente para este tipo de sistemas en el tiempo, hay buena manutención a largo plazo en las resiembras y el escalamiento. Pueden requerir un mayor gasto energético. 

Fotobiorreactores cerrados. Geometrías (de izq. a der.) matraz, tubular y en panel (Guangyu biological technology Co., LTD, 2023).

Sistemas abiertos: No existe una barrera física entre los cultivos de microalgas y el ambiente, los cultivos se encuentran «al aire libre». Esta aplicación reduce costos pero disminuye la calidad de los cultivos. En el tiempo, el cultivo de microalgas presentará una carga de bacterias, hongos, otras microalgas/cianobacterias y ciliados, que son depredadores de microalgas y pueden reducir la población de las mismas en un tiempo logarítmico. 

Fotobiorreactores abiertos. Geometrías (de izq. a der. y arr. a ab.) «Raceway»,»Circular pond», «Unstirred». (Frank Fields, UC San Diego s.f.),(Guangyu biological technology Co., LTD, 2023). 

Referencias

1. Li, Y., Miros, S., Kiani, H. et al. Mechanism of lactose assimilation in microalgae for the bioremediation of dairy processing side-streams and co-production of valuable food products. J Appl Phycol 35, 1649–1661 (2023). https://doi.org/10.1007/s10811-023-03002-2
2. Inwongwan S, Kruger NJ, Ratcliffe RG, O’Neill EC. Euglena Central Metabolic Pathways and Their Subcellular Locations. Metabolites. (2019) Jun 14;9(6):115. https://doi.org/10.3390/metabo9040076
3. Lesley A. Clementson, Bozena Wojtasiewicz, Dataset on the absorption characteristics of extracted phytoplankton pigments, Data in Brief, Volume 24, (2019)
   https://doi.org/10.1016/j.dib.2019.103875.
4. Cha TS, Chen CF, Yee W, Aziz A, Loh SH. Cinnamic acid, coumarin and vanillin: Alternative phenolic compounds for efficient Agrobacterium-mediated transformation of the unicellular green alga, Nannochloropsis sp. J Microbiol Methods. (2011) Mar;84(3):430-4. doi: 10.1016/j.mimet.2011.01.005.
5. Barrios-Ziolo et. al. Estudio de la toxicidad asociada al vertimiento de aguas residuales con presencia de colorantes y pigmentos en el área metropolitana del Valle de Aburrá. Revista EIA, ISSN 1794-1237 / Año XIII / Volumen 13 / Edición N.26 / Julio-Diciembre 2016 / pp. 61-http://www.scielo.org.co/pdf/eia/n26/n26a05.pdf