Protocolos
Eliminación de hongos en cultivos de microalgas
En el fascinante mundo de la microbiología, los organismos nos sorprenden con su diversidad y características extraordinarias. Las microalgas remueven CO2 del ambiente para producir metabolitos únicos, valiosos en la fabricación de alimentos, farmacéuticos y cosméticos. Países como Japón y China gozan de una bioeconomía carbono-negativa viento en popa, basada en microalgas. La compañía japonesa Euglena Co., además de innovar en múltiples fármacos y suplementos alimenticios basados en metabolitos de Euglena, ha logrado propulsar buses de transporte público y aviones comerciales con biodíesel de microalgas [1].
Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis en fotobiorreactor tubular (Guangyu biological technology Co., LTD , República popular de China, 2023).
Las microalgas, al igual que cualquier otro cultivo, están sujetas a la contaminación por hongos patógenos. Este tipo de contaminación afecta significativamente la calidad y bioseguridad del producto final. En el contexto de los bioprocesos, los hongos patógenos actúan como inhibidores del crecimiento en todas las etapas del flujo operativo, a corto, mediano y largo plazo.
- Dificultan el crecimiento: lo que se traduce en alto uso de recursos (energético, en materia prima y en mano de obra), obteniendo bajos rendimientos.
- Impiden su preservación: en el laboratorio, se observa una disminución progresiva de la integridad del recurso vivo, que puede derivar en su pérdida total y en la pérdida de la biodiversidad preservada in vitro.
- Añaden toxinas al medio: mala a nula calidad del producto final, especialmente preocupante en aplicaciones cosméticas, alimentarias y farmacéuticas.
Es fundamental contar con un protocolo de laboratorio eficiente para garantizar la calidad y pureza de las microalgas.
En este artículo, explicaremos un protocolo detallado que te permitirá proteger tus cultivos y maximizar su rendimiento.
Estrategia de purificación en términos generales
1. Choque osmótico: Invertir la salinidad del cultivo
Este enfoque se fundamenta en que, la microbiota procarionte que acompaña a las microalgas carece de mecanismos para regular cambios drásticos en la osmolaridad del medio. El primer paso implica modificar la salinidad del cultivo, “a la inversa”, es decir cultivar algas dulceacuícolas en agar marino (adaptación de 0.0% a 3.0% NaCl) y cultivar algas marinas en agar dulceacuícola (adaptación de 3.0% a 0.0% NaCl).
La relevancia es que posibilita la eliminación de bacterias del cultivo sin el uso de antibióticos. En este paso, los hongos sí pueden crecer, en caso de que se desee identificarlos para su posterior eliminación.
2. Ajustar un pH alcalino (pH 8.5 ± 0.2)
En la preparación del agar de choque osmótico, es importante ajustar su pH a un valor igual o superior a 8.5. Este valor es ligeramente superior al valor estándar neutro del agua (pH 7.0), pero suficiente para ejercer una presión de selección efectiva, ya que los hongos no se adaptan bien en ambientes alcalinos. En este valor de pH 8.5 las microalgas sí pueden crecer, así estamos mejorando las posibilidades de eliminar contaminación.
En la mayoría de los casos, estas dos acciones son suficientes para obtener cultivos libres de hongos y bacterias.
3. Diseñar una batería de fungicidas
Los fungicidas son compuestos químicos que pueden inhibir o eliminar completamente el crecimiento de los hongos. Adicionalmente, al elegir fungicidas solubles en etanol, podemos asegurarnos de que se disperse uniformemente en el medio de cultivo y que además ejerce actividad antiséptica (en soluciones al 70% de etanol). Una batería o «cóctel» antibiótico implica la adición de uno o más compuestos antibióticos en el medio. Pueden ser adicionados al agar sólido o brevemente antes de solidificar.
Tabla 1. Fungicidas utilizados por la Colección CCAB
| Compuesto | Concentración | Solubilidad |
|---|---|---|
| Carbendazim | 1 μm/mL – 100 μm/mL | Ligeramente soluble en agua |
| Plant Preservative Mixture | 1 μm/mL – 100 μm/mL | Soluble en agua |
| Fluconazol | 1 μm/mL – 100 μm/mL | Soluble en etanol |
Metodología aplicada
Organismos de estudio: Pediastrum boryanum y Chlorella vulgaris, cultivos de microalgas dulceacuícolas contaminadas por un moho algodonoso.
A. Prepare un medio de cultivo marino al 3.0% de salinidad, tal como Guillard’s F/2 ó ASW. Los laboratorios de vida marina podrían preferir utilizar agua de mar, cuya salinidad puede variar del 2.0% – 3.5%, dependiendo de la región. Ajuste pH 8.5 ± 0.2. Adicione 2% de agar. Esterilice a 121°C, 15 PSI, 20 minutos.
B. Con precaución, decante el agar marino para preparar placas de Petri. Permita su solidificación.
C. Preparar un stock de fungicida en un rango de 1 μg/mL-100 μg/mL, según su diseño de experimentos. Para evitar el desarrollo de resistencia prefiera trabajar con concentraciones bajas de fungicidas, rote el uso de compuestos de manera oportuna.
D. Bajo condiciones estériles, con un asa de nicromo flameada, tome una masa grande de células para sembrar mediante estriado por agotamiento.
Nota: Para realizar un choque osmótico de microalgas marinas, subcultive en un medio mineral de agua dulce, tal como Bold’s Basal Medium, no agregue fuentes de carbono.
Resultados esperados
Purificación de la microalga Pediastrum boryanum CCAB 111/41 A) Antes del protocolo de presión osmótica y de pH B) Después del protocolo de presión osmótica y pH, 4 días de maduración a 25°C, 1000 lux. Fotografía a 100X del estriado sobre agar. (Zárate-Rivera, Ana Karen, 2023. Colección de Cultivos Algae Bank).
Purificación de la microalga Chlorella vulgaris CCAB 100/41 A) Antes del protocolo de presión osmótica y de pH B) Después del protocolo de presión osmótica y pH, 4 días de maduración a 25°C, 1000 lux. Fotografía a 100X del estriado sobre agar. (Zárate-Rivera, Ana Karen, 2023. Colección de Cultivos Algae Bank).
Conclusión
En un laboratorio de conservación de microbios, la aplicación de este protocolo no solo ayudará a mantener cultivos de microalgas libres de hongos, sino que también permitirá la exploración y el estudio de las propiedades y aplicaciones potenciales de estos microorganismos increíbles. El estudio detallado de estas fascinantes criaturas puede llevar a descubrimientos sorprendentes sobre sus aplicaciones potenciales en diversos campos.
Con el uso adecuado de protocolos de purificación, no solo se garantiza la conservación efectiva y segura de los microbios, sino que también se abre un mundo emocionante para la exploración científica.
