La diferencias observadas en las propiedades de tinción se deben a las diferencias estructurales de pared celular.

En Gram-positivas la conformación de pared celular consta de una capa gruesa de peptidoglicano (o mucopéptido, matriz de proteínas glicosiladas negativamente cargadas) que cubre de manera rígida a la suave membrana celular. Esta estructura bioquímicamente densa tiene afinidad de cargas con el tinte ocasionando la retención de cristal violeta. Además, el lugol precipita al tinte dentro de las células lo que dificulta aún más su lavado. Así, las gram-positivas obtienen un característico color azul-púrpura.

En Gram-negativas, la pared celular se conforma una capa delgada de peptidoglicano intermedia a dos membranas citoplasmáticas suaves. Con una densidad molecular relativamente baja, la capa rígida de peptidoglicano no puede retener la tinción violeta. En este microambiente, el agente decolorante se disuelve. La observación se realiza mediante tintes de contraste, como la safranina. Presentando células color rojo.

Notas adicionales:
En realidad la diferencia de color no es específica de la pared bacteriana: todas las células sin pared, como las animales, pierden fácilmente el cristal violeta. Todas las células con pared gruesa, como las de hongos, se verán de color violeta. La correlación entre el color y el tipo de pared solo tiene sentido con células bacterianas (salvo excepciones) [Iáñez, s-f-].